En 1542, su padre es nombrado funcionario de la Cancillería de Granada, y Luis es enviado a un colegio de Salamanca para cursar sus estudios. En 1543, ingresa en el Convento de San Pedro, (Orden de los Agustinos en Salamanca u Orden de San Agustín). En 1544, profesa, sin dejar sus estudios universitarios.
Obtiene la licenciatura en Teología, y se dedica a dar clases. Luego estudia hebreo en a la Universidad de Alcalá actividad que resultaría decisiva, para estudios filológicos y su interpretación de la Biblia.
El 1561, obtiene la cátedra de Santo Tomás. Dirige la cátedra hasta 1565, fecha en la obtiene una cátedra en Durando. Estudioso de la teología, la retórica y las lenguas clásicas, los modelos literarios en lengua vulgar, y los recursos expresivos de los idiomas.
En 1576, fue absuelto amonestado por haber tratado “temas peligrosos” y se le confiscó la versión castellana del Cantar.
Al volver a la Universidad, Fray Luis empeoro su actitud debido a la confianza que tenia de sus conocimientos. Lo que le lleva de nuevo ante la Inquisición en 1579 y 1582. Con el tiempo llevaría el peso de la reforma de la Orden agustiniana.
En 1583, publicó La perfecta casada. Entre 1574-1575, De los nombres de Cristo. En 1637, veintitrés poemas publicados por primera vez por Quevedo. Todas estas obras muestras de su erudición, prosa hablar clásico y limpio, y sus poemas regidos por el ritmo y el tono que dominaba con maestria.
En 1591 es Vicario General de Castilla y poco después Provincial, cargo que casi no llegó a disfrutar, pues la muerte le sorprendió once días más tarde, en una visita a Madrigal de la Altas Torres. Sus restos fueron llevados al convento de San Agustín de Salamanca, destruido en el siglo XIX, pero hoy reposan en la capilla de la Universidad de Salamanca.
La última obra en prosa de Fray Luis de León fue Exposición del Libro de Job (1779) cuya génesis tuvo lugar en la cárcel. En su primera parte, Job se lamenta y protesta contra Dios, pero en los capítulos siguientes el discurso se templa en las acusaciones de Eliú, quien representa la razón humana; más tarde emerge la figura de Dios, quien al fin pone de manifiesto las maravillas de la creación.
De sus versos, Fray Luis murió sin haber publicado sus poesías, su obra poética no fue editada hasta 1631, los últimos años de su vida los dedicó a reunir su obra poética, pero nunca llegó a publicarla.